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mRNA疫苗体外合成完整解决方案

RNAScript 2023-12-01

以下材料来自网络,专业介绍了mRNA疫苗生产的基本流程和常用酶制剂的用途,供对mRNA疫苗感兴趣的同行参考。(--编者)



   随着生命科学的不断进步,mRNA作为药物被应用到疾病治疗、疫苗等领域。从1990年体外合成的mRNA第一次在细胞内表达,到2020年的mRNA疫苗在对抗新冠疫苗发挥重要作用。以mRNA为基础的治疗方式已经在医药领域引起了一场革命。

        mRNA(Messenger RNA、信使RNA)是将DNA中的基因信息传递到蛋白的中间信使。mRNA疫苗治疗(见下图)是指在体外合成mRNA,将其导入体内,mRNA进入细胞后翻译表达出抗原蛋白,抗原刺激体内免疫系统,激活体液免疫和细胞免疫,当机体再次接触同种抗原(细胞/病毒),可产生快速免疫应答反应,自我保护。

mRNA疫苗研发-生产-治疗流程  图片引用于 Novoprotein Scientific Inc.

        mRNA疫苗具有研发速度快、灵活、生产工艺简单、平台化、容易扩充产能,可以用于精准化和个性化治疗,一次可呈递多种抗原等优点。mRNA疫苗属于第三代疫苗技术(见下图),相比于传统疫苗需要通过将病原微生物及其代谢产物通过人工灭毒﹑减活﹑基因工程的方法制成的繁杂工序,第三代疫苗特异性更强,有效性更高,并且研发周期较快。它的结构简单、可人工批量合成,并且可以在研发阶段进行高通量筛选,大大节省研发时间。而且相较于DNA疫苗,mRNA疫苗没有导入外源基因的遗传风险,起效更快,效果更强。

mRNA疫苗相对于其他疫苗的优势  图片引用于网络

        mRNA疫苗具有工艺通用性好,研发速度快,能够活化细胞免疫,刺激效果好,递送效果好等特性。高的mRNA产量需要高效的mRNA体外合成方法,大规模生产选择T7 RNA聚合酶体外转录。增强mRNA的稳定性,降低免疫原性并提升翻译效率,最有效的解决方案是:使用加帽酶对mRNA进行加帽,使其在细胞内外稳定,降低免疫原性,并且使mRNA可以被核糖体识别,启动翻译程序。


    近岸蛋白质提供一系列mRNA体外合成酶及试剂,解决mRNA疫苗的关键痛点。所有产品均采用药用规格原辅料生产,严格控制宿主蛋白质残留、核酸残留及常见病原体污染,符合GMP规范的产品生产与质量管理规程,保障生产过程及所有原辅料可追溯。


产品特点:

GMP级mRNA体外合成及修饰原料,animal-free,ampicillin-free

产品生产、质量控制及配套文件体系,符合mRNA疫苗及药物研发生产需求

经过临床使用验证,单批次产能千万人份,年产能50亿人份

       

mRNA疫苗体外合成关键步骤及相关产品:



1、生成模板-质粒线性化 相关产品:Bsa I,GMP Grade(货号:GMP-RE026)

        此步将构建好的质粒酶切,处理成线性化双链DNA模板,用于下一步mRNA合成。

        限制性内切酶Bsa I 特异性识别双链DNA中位点并进行酶切,可将模板质粒酶切线性化,作为mRNA体外合成模板;

        酶切位点:

产品特点:

        强特异性

        受CpG、Dcm甲基化影响,剪切阻断

        受EcoBI甲基化影响,剪切可能受影响

        不受Dam甲基化影响


2、mRNA体外合成  相关产品:T7 RNA Polymerase, GMP Grade (货号:GMP-E121)

此步以DNA为模板,在体外由RNA聚合酶催化合成mRNA。

T7 RNA Polymerase(T7 RNA聚合酶)是高度特异识别T7启动子序列的5'→3' RNA聚合酶,以含有T7启动子序列的单链或双链DNA为模板,以NTP为底物,合成与启动子下游的单链DNA互补的RNA。T7 RNA聚合酶是体外转录mRNA的关键酶。

产品特点:

高度特异识别T7启动子

20ul反应体系,产量可达150ug

可对低至1ng模板进行有效转录

合成长度可达15k


体外转录产生的mRNA,Qsep1结果显示,纯度高,均一性好。



3、mRNA转录后修饰:加帽加尾

   此步对mRNA进行修饰,合成功能完整的mRNA。


完整mRNA结构


3.1、mRNA加帽(Cap0)   相关产品:Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade (货号:GMP-M062)        

此步与3.2同时进行,在mRNA的5'端加上Cap0帽结构。

在真核生物中,转录后的mRNA必需经过一系列修饰才能形成完整的结构,即在5'端形成一个帽子结构(Cap1),3’端形成PolyA尾结构。这些结构与mRNA的稳定、转运和翻译密切相关。

 Vaccinia Capping Enzyme(牛痘病毒加帽酶)用于给体外转录合成的mRNA催化加上帽子结构(Cap0),显著改善mRNA的稳定性和翻译能力,使mRNA可在细胞内表达蛋白,避免核酸外切酶等的降解破坏。

mRNA的帽结构是由一个7-甲基鸟苷通过一个5′–5′三磷酸酯桥连接到mRNA 链的5′核苷上组成。Cap-0结构由相邻的RNA链通过三种酶的依次反应形成。进一步形成cap-1结构需要2-O甲基转移酶(Cat. No: GMP-M072, Novoprotein)参与,该修饰可以降低RNA在体内引起的细胞先天免疫反应。


产品特点:

高效完成mRNA加帽Cap0   

提高mRNA的稳定性,防止被RNA酶降解                                                           

提高mRNA的翻译效率,提高蛋白产量


3.2、mRNA加帽(Cap1)  相关产品:mRNA 2’-O-Methyltransferase, GMP Grad e (货号:GMP-M072)

此步与3.1同时进行,在mRNA的5'端加上Cap0帽结构的基础上,再将Cap0转化为Cap1结构。

真核生物中,mRNA的转录后须经系列修饰,在5'端形成一个特殊结构,即帽子结构,3’端形成PolyA尾结构。这些结构与mRNA的稳定、转运和翻译密切相关。已知Cap1结构存在于所有真核生物mRNA,在稳定mRNA结构和提高翻译效率方面起重要作用。研究表明,体外转录修饰得到的Cap1结构mRNA更不容易被免疫系统的RNA感受器(RIG-I)识别,因此免疫刺激更低。

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferas (2´-O-甲基转移酶)可利用 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体, 在 RNA 5´末端紧邻帽结构(Cap 0)的第一个核苷酸的 2´-O 上添加甲基基团,形成带有 Cap 1 结构的 mRNA。Cap1 结构能增强 mRNA 的翻译效率,从而可提高转染后 mRNA 编码的蛋白表达水平。该酶只能以带 7-甲基鸟苷帽结构(m7GpppN)的 RNA 为底物,不会作用于 5´末端为pN、ppN、 pppN 或 GpppN 的 RNA。带 7-甲基鸟苷帽结构(m7GpppN)的 RNA 可通过 Vaccinia Capping System(Cat. No: GMP-M062, Novoprotein)来制备。


产品特点:

使mRNA的Cap 0帽子甲基化为 Cap 1帽子

提高 RNA 的翻译效率,提高蛋白产量

进一步降低免疫原性


完整mRNA在细胞内表达GFP蛋白,加帽酶与帽类似物对比


3.3、mRNA加尾(PolyA)  相关产品:E. coli Poly(A) Polymerase, GMP Grade (货号:GMP-M012)

此步在mRNA的3'端加上PolyA尾。

真核生物中,mRNA的转录后须经系列修饰,在5'端形成一个特殊结构,即帽子结构,3’端形成PolyA尾结构。这些结构与mRNA的稳定、转运和翻译密切相关。Poly A与成熟mRNA的稳定性、翻译起始以及出核运输有关,体内转录后修饰中,polyA聚合酶在RNA 3’-OH上逐一引入100-200个A碱基。

体外转录RNA过程中,E. coli Poly (A) Polymerase(加尾酶) 不依赖模板的存在,可以催化 ATP 以 AMP 的形式依次掺入到 RNA 的 3´末端,即在 RNA 的 3´末端加多聚 A 尾。Poly (A) 聚合酶具有很高的加尾效率,可以在 RNA 的 3´末端加入 20~200 个 A 碱基。最大程度还原体内加尾过程。

产品特点:

稳定mRNA的存在形式

引导转录终止

提高RNA在真核细胞中的翻译效率


4、其他相关产品


4.1、防止mRNA降解  相关产品:RNase inhibitor, GMP Grade (货号:GMP-E125)

在流程2-3 mRNA合成与修饰中加入RNase Inhibitor,防止RNA降解。

RNase Inhibitor可与RNase  A形成1:1复合体,对RNase 有极强非竞争性抑制,保护mRNA转录后不被降解

产品特点:

强抑制RNase活性

稳定性强


4.2、降解模板DNA  相关产品:DNase I, GMP Grade (货号:GMP-E127)

        在流程2 RNA合成结束后,去除模板DNA。

DNase I将单链或双链DNA随机分解。

DNase I 去除RNA样本种的DNA残留


4.3、增加mRNA产量  相关产品:Pyrophosphatase, Inorganic (yeast), GMP Grade (货号:GMP-M036)

        在流程2 RNA合成过程中加入无机焦磷酸酶,增加RNA产量。

        无机焦磷酸酶PPase(Pyrophosphatase, Inorganic)可催化无机焦磷酸盐水解生成正磷酸盐(P2O7-4+H2O+PPase→2HPO4-2),一方面可去除无机焦磷酸盐对反应体系的抑制,另一方面为反应提供热力学动力,促进产物的生成。常用于RNA、DNA、蛋白质的生物合成中,是一种良好的辅剂,在mRNA疫苗体外大规模合成中加入可显著提高产量。


无机焦磷酸酶去除mRNA合成过程中产生的焦磷酸,提高mRNA产量


(资料来源:近岸蛋白质网站;点击“阅读原文”可以查看原始链接,版权归原作者所有,如有侵权,请联系我们删除。)



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