谭天伟/朱玉山/盛翔Chem Catal封面文章：计算酶设计实现己二酸生物合成 | Cell Press论文速递
物质科学
Physical science
2024年7月4日，北京化工大学谭天伟院士、朱玉山教授与中国科学院天津工业生物技术研究所的盛翔研究员等在Cell Press细胞出版社期刊Chem Catalysis上发表了一篇题为“Computational redesign of an enoate reductase for the in vivo production of adipic acid from muconic acid”的最新成果，并成为2024年8月刊封面文章。
在本工作中，各课题组根据自身优势学科，结合了蛋白质结构预测、量子化学计算、计算酶设计和分子动力学模拟等多种计算手段，提出了一种有效的多尺度计算策略进行烯酸还原酶的再设计，从而大大提高了酶活性和己二酸产量。这一成果表明，在工业条件下，通过生物还原葡萄糖衍生的顺式,顺式-粘康酸进行从头生物合成己二酸是有前景的。
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己二酸是化学制造中最重要的二元羧酸之一，主要用于合成尼龙-6,6、可降解塑料PBAT、聚氨酯和增塑剂的原料。此外，它还在食品工业中用作食品添加剂和调味剂。全球己二酸的年产量已超过300万吨，预计到2025年将达到80亿磅。目前，己二酸主要通过石化路线生产，例如通过KA油（环己醇和环己酮的混合物）的硝酸催化氧化来进行化学合成。此过程会产生大量的温室气体N2O，其全球变暖潜力是CO2的298倍。己二酸化学制造产生的N2O排放量约占工业N2O总排放量的80%，具有大约96.2%的工业减排潜力。
利用可再生原料生产己二酸可以有效减轻与石化路线相关的环境污染。目前，生物基己二酸需要通过基因工程和代谢工程整合外源基因来构建人工合成途径。己二酸的生物合成途径主要分为两类：(1) 完全生物合成，包括反向己二酸降解途径、β-氧化或反向β-氧化与ω-氧化途径的结合，以及2-氧己二酸途径，这些方法都已被证明是可行的；(2) 先生物合成己二酸前体，然后再进行化学转化：这种方法涉及将可再生生物质转化为顺式,顺式-粘康酸或葡糖酸，然后通过化学方法生产己二酸。然而，传统的化学加氢使用碳负载的Pt或Ru10Pt2纳米粒子作为催化剂，不可避免地导致重金属高价和工业污染等问题。此外，这种方法与绿色化学的基本原则不一致。因此，寻找完全生物合成的方法变得尤为重要。
图1 谷氨酸棒状杆菌中粘康酸生产的代谢途径（图片来自Li M, Chen J, He K, Su C, Wu Y, Tan T. Corynebacterium glutamicum cell factory design for the efficient production of cis, cis-muconic acid. Metab Eng. 2024;82:225-237.）
1994年，Frost等首次报道了一种使用葡萄糖作为碳源的半生物合成方法，生产顺式,顺式-粘康酸，在摇瓶和生物反应器中的产量分别达到约2.4 g/L和38.6 g/L，这表明从葡萄糖到顺式,顺式-粘康酸的生物合成已满足工业化的要求。并且本课题组使用葡萄糖作为碳源，通过谷氨酸棒杆菌发酵可以获得的顺式,顺式-粘康酸产量最高达到88.2 g/L。先前的研究已确认，梭状芽孢杆菌和芽孢杆菌的烯酸还原酶（ERs）具有将顺式,顺式-粘康酸转化为己二酸的催化活性。其中，来自Heyndrickxia coagulans的烯酸还原酶（ERBC）表现出最高的转化率。虽然通过顺式,顺式-粘康酸的生物合成己二酸途径看似可行，但将顺式,顺式-粘康酸转化为己二酸的关键酶活性较低，这成为该途径工业化的重大障碍。烯酸还原酶活性提升是目前亟待解决的问题，而计算酶设计则是改变酶活性的重要方法之一。
图2 通过顺式,顺式-粘康酸从头合成己二酸的代谢途径。
近日，北化朱玉山谭天伟课题组，设计了一种有效的多尺度计算策略来设计活性增强的突变体。生成了一个仅包含15个变体的聚焦文库。实验验证证实，最佳突变体M8(G27M/I374S)的体内活性相比野生型酶增强了14.2倍。在10 mM底物浓度下，己二酸产量达到0.9g/L，产率为61%，约为野生型（3.2%）的19倍。这一成就标志着从可再生资源中完全生物合成己二酸方面的重要进展。
图3 计算设计流程图。
由于缺乏高分辨率的烯酸还原酶ERBC晶体结构，其催化机制在很大程度上仍然未知。这阻碍了基于结构的计算设计方法来增强酶活性。首先，作者使用AlphaFold2进行结构建模，结构模型的整体pLDDT置信度均高于95.4，活性口袋内催化残基的pLDDT均超过90。基于预测的结构，作者需要确定ERBC的催化位点和辅因子结合位点。通过将ERBC与11种同源酶的序列比对确定ERBC中的对应催化残基为180Y。通过分析同源厌氧酶的结构，推断出ERBC中各种辅因子的结合位置：类似OYE的TIM桶域结合FMN（残基1-356），α/β域结合FAD（残基404-524），[4Fe-4S]簇位于TIM桶和FAD结合域之间的连接区域（残基357-403），C端域结合NAD(H)（残基525-663）。随后作者进一步重建FMN在ERBC中的结合位置。基于序列和结构比对，五种同源酶中与FMN形成关键氢键的残基位置完全保守，并确定ERBC中与FMN形成氢键的关键残基。最后利用计算酶设计工具PRODA中的小分子放置模块准确再现了FMN在活性口袋中的结合位置。
图4 ERBC的结构预测。
作者采用量子化学簇方法研究了ERBC催化的过程中，将顺式，顺式-粘康酸转化为2-烯己二酸的初始步骤的反应机制。还在计算研究中考虑了将2-烯己二酸还原为己二酸的第二步骤。然而，初始步骤的能垒为21.0 kcal/mol，高于第二步骤的19.3 kcal/mol，这与实验结果一致。因此详细讨论了将顺式，顺式-粘康酸还原为2-烯己二酸的反应机制。基于当前的计算结果，提出了一个两步反应机制。首先是完全还原的辅酶FMN向底物进行氢化物转移，随后Tyr180向底物的Cα原子进行质子转移。氢化物转移步骤的能垒计算为21.0 kcal/mol（WT-TS1），产生的烯二醇负离子中间体（WT-Int）的能量为8.5 kcal/mol。接下来的质子转移步骤的能垒为8.8 kcal/mol（WT-TS2）。这些结果表明，该反应的限速步骤是氢化物转移，而Tyr180向底物的质子转移是容易的。基于提出的催化机制，限速步骤（WT-TS1）的过渡态结构被用来指导后续的计算酶设计。
图5 量子化学计算ERBC的催化机理。
作者发现ERBC的天然酶活性低是由于其限速步骤的反应能垒高。为了提高催化合成己二酸的活性，有必要重新设计ERBC的活性位点，以更好的稳定顺式,顺式-粘康酸还原步骤中形成的过渡态。作者观察到，TS在野生型ERBC的口袋中结合时，羧基原子O7和O8与疏水残基相互作用，而缺乏与极性残基的稳定相互作用。中间的亚甲基部分缺乏与非极性残基的疏水相互作用。为了进一步稳定TS与其相应催化残基之间的几何约束，作者采用计算酶再设计，改造结合口袋并增强活性位点周围残基的堆积。7个设计位点的氨基酸残基（G27、L29、V61、H287、M371、I374、L380）在16种氨基酸类型（A、V、L、I、M、F、W、C、S、T、N、Q、R、Y）之间变化。采用PRODA中的确定性全局优化算法，总共生成了430个序列，包括28个单突变，202个双突变和200个三突变变体，旨在最小化酶-TS复合物的自由能。计算结果表明，超过90%的序列（395/430）相对于野生型ERBC表现出较低的总自由能。此外，超过85%的序列（380/430）显示结合能降低，这主要通过在活性口袋内增加额外的氢键或改善疏水环境实现。
图6 野生型及突变体的过渡态结合构象。
在PRODA的建模方法中采用了一些假设，如刚性主链、隐式溶剂和离散的侧链构象库，以减少计算负载。然而，这可能会导致计算结果出现假阳性。因此，进一步使用分子动力学模拟对PRODA设计的序列进行评估。选择序列进行高通量MD模拟评估的标准如下：(1) 相对于野生型，计算出的总自由能变最高的前30名；(2) 相对于野生型，计算出的结合自由能变化最高的前30名；(3) 增强与周围残基的疏水相互作用或氢键的突变；(4) TS及其周围结合残基是否采用有利的构象。共选择了141个符合标准的序列通过20次独立的1ns短MD模拟进行了评估。
为了有效评估在MD模拟过程中，顺式，顺式-粘康酸双键还原的过渡态构象的稳定性，设置特殊的约束模型以匹配过渡态构象。通过迭代测试确定了六个催化指标，包括两个接触距离和四个二面角，以评估ERBC的催化性能。考虑到PRODA计算和高通量MD模拟，基于以下标准，从这140个设计序列中选择了15个变体进行实验验证：(1) PRODA计算的总自由能变化；(2) PRODA计算的结合自由能变化；(3) 在高通量MD模拟中，相对于野生型至少在四个指标上有所改进；(4) 在高通量MD模拟中，这些指标相比于野生型有更高的改进程度。
图7 MD模拟中的评价指标。
由于ERBC结构中存在[4Fe-4S]簇，它对氧敏感，作者在厌氧条件下采用体内酶活性测定法来表征野生型ERBC和设计突变体的催化活性。其中，四个突变体在催化顺式,顺式-粘康酸时表现出相对于野生型增加的活性。M1（G27M）活性增加了2.6倍；M7（G27M/I374T）活性增加了1.8倍；M8（G27M/I374S）活性增加了14.2倍；以及M13（G27M/M371S/I374T）活性增加了2.6倍。当这些突变体用于催化2-烯己二酸时，除了M8对2-烯己二酸的活性增加了1.9倍，其他三个变体表现出与野生型相当的活性。这表明，设计序列的进化方向主要围绕顺式,顺式-粘康酸作为底物。
图8 ERBC对于顺式,顺式-粘康酸（a）和2-烯己二酸（b）的催化活性。
目前，从顺式,顺式-粘康酸工业生物合成己二酸的主要障碍是现有产量和产率低的问题。作者测量了野生型和M8突变体在加入等量细胞后的己二酸产量变化。加入20 mM顺式,顺式-粘康酸后，反应8小时后野生型产生约0.43 mM己二酸（转化率2.2%），而M8突变体达到8.62 mM己二酸（转化率43%）。M8突变体的己二酸产量和产率大约是野生型的20倍。此外，作者还研究了使用不同浓度的2-烯己二酸作为底物的反应。当加入10 mM 2-烯己二酸时，M8突变体的己二酸产量与野生型相似（M8突变体为9.79 mM，野生型为8.35 mM），且两者均达到高转化率（M8突变体为97%，野生型为83%）。这表明野生型已经对2-烯己二酸具有高催化活性，使其迅速达到平衡转化。加入20 mM 2-烯己二酸后，M8突变体在己二酸产量上明显优于野生型（M8突变体为18.27 mM，野生型为11.22 mM），尽管两者的转化率均有所下降，M8突变体仍保持较高水平（M8突变体为91%，野生型为56%）。这再次强调了设计的M8突变体对2-烯己二酸的增强催化效果。
图9 以顺式,顺式-粘康酸（a，b）和2-烯己二酸（c，d）为底物进行反应的产量。
作者进一步从分子角度分析了高活性突变体M8(G27M/I374S)的构象动力学。在对M8进行的多次短MD模拟中，记录了六个催化指标的频率分布。与野生型相比，在M8中，Y180残基上的OH原子与TS上的C11原子之间的距离（D2）分布（图5d）相比野生型有显著改善。3.2 Å左右的频率值增加了约30%。其他三个与催化相关的二面角的分布均向TS构象的角度（图中以黄色虚线表示TS值）发生了不同程度的位移。这表明在野生型中，小分子倾向于集中在不正确的构象上，而在M8突变体中，小分子结合的构象发生了显著的转变。与野生型相比，小分子更倾向于分布在催化几何结构周围，从而在实验条件下表现出增强的催化性能。
图10 WT和M8突变体的MD模拟指标频率分布。
上述的分子动力学模拟结果提供了突变如何影响构象动态的信息。作者为了深入了解突变引起的反应能垒变化，对所有设计的突变体中效率最高的M8(G27M/I373S)，相应的单突变体M1(G27M)、M3(I373S)，以及比野生型酶活性更高的三重突变体M13(G27M/M371S/I374T)进行了全反应的量子化学计算。计算结果完美地复现了这些突变体在反应活性上的实验趋势。
图11 ERBC突变体的反应能垒计算。
在这里，作者开发了一种计算设计策略用于增强酶的催化活性，该策略整合了蛋白质结构预测、量子化学计算、计算酶设计和高通量分子动力学模拟。这种策略被应用于设计能高效合成己二酸的烯酸还原酶ERBC的高活性突变体，展示了以催化机制为导向的计算设计方法在快速提高酶活性方面的效率。这一成就表明，在工业条件下成功生产己二酸是有希望的。此外，本课题组已经能够实现在谷氨酸棒状杆菌中的粘康酸高产（Li, M., Chen, J., He, K., Su, C., Wu, Y., and Tan, T. (2024). Corynebacterium glutamicum cell factory design for the efficient production of cis, cis-muconic acid. Metabolic Engineering 82, 225-237.），未来将粘康酸的生物合成与烯酸还原酶耦合实现己二酸的从头生物合成会成为极具前景的生物制造工艺。
作者介绍
张世鼎
博士
张世鼎，论文第一作者，本科毕业于北京化工大学生物工程专业，博士毕业于北京化工大学化学工程与技术专业。研究方向：生物化工及计算酶设计。
相关论文信息
论文原文刊载于Cell Press期刊Chem Catalysis，
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▌论文标题：
Computational redesign of an enoate reductase for the in vivo production of adipic acid from muconic acid
▌论文网址：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2667109324002008
▌DOI：
https://doi.org/10.1016/j.checat.2024.101042
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