CAR-T疗法的深入总结

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随着科学技术的发展，很多医学难题逐渐得到改善。对于血液性恶性肿瘤而言，时下最流行的治疗方法莫过于CAR-T疗法 (chimeric antigen receptor T cells)。2021年，国内首款CAR-T产品上市(截止目前全球共有7款CAR-T产品上市，其中国内2款，分别来自复星凯特和药明巨诺)，标价120万人民币，相较于美国均价40万美元的CAR-T产品而言，着实实惠了很多。

任何事物发展都有其历史，科学研究也不例外，其中有传承，有坎坷。CAR-T疗法属于过继免疫疗法（ACT）的一种，其家族中还包括TIL，TCR-T，CAR-NK等历史或未来有希望的方法。（医学研究就好像股市一样，不能说哪种方法好，哪种不好，不同的方法，不同的适应症，不同的适用对象，今天的效果不佳，可能会随着相关学科的发展，成为明日的黑马，正如mRNA技术一样，随着新冠疫苗的热门而被搬向台前。）最早成功的癌症过继免疫疗法案例是1956年E. Donnall Thomas教授通过双胞胎间骨髓移植治疗白血病，避免移植物抗宿主病（GVHD）-即供体特异性免疫细胞由于未经过受体抗原免疫耐受而发动攻击对受体造成多脏器损伤甚至引起死亡。同时，导致移植失败。（这就好像两军对战，虽然都是同类，但由于各侍其主，一定要斗个鱼死网破，两败俱伤。）

随后，Miller等人发现了T细胞起源-源于造血干细胞（胎儿骨髓和心脏），成熟于胸腺。直到1986年Steven Rosenberg报道了一项关于肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的研究，才将人们的目光锁定在“通过患者自身的免疫细胞可以对抗自身癌症”的理念上。

1992年，Sadelain等人成功地建立了逆转录病毒介导的基因转移到T淋巴细胞的方法，使基因修饰成为在实验或治疗环境中控制免疫的手段。这些都为CAR-T技术的产生做了铺垫。

谈及CAR-T技术，不得不涉及TIL，TCR-T，CAR-NK，这些免疫细胞来源的天然和人工衍生物，在细胞治疗肿瘤领域有着千丝万缕的联系。

TIL (tumor-infiltrating lymphocytes) 治疗一般从患者肿瘤组织中提取TIL，经体外扩增培养后回输入病人体内。2002年，来自于美国国家癌症研究所（NCI）的Steven Rosenberg教授就将此法用于转移性黑色素瘤患者治疗。

TIL疗法有诸多限制：1、不是所有患者的肿瘤组织都会产生淋巴细胞 2、提取的淋巴细胞不一定有抗肿瘤活性 3、即便有抗肿瘤活性患者也不一定能等待8周的时间以扩充培养这些淋巴细胞。因此，尽管有高达50%的治疗响应率，TIL疗法却没能得到广泛应用。

这些限制促使研究人员寻求更具广泛意义的T细胞。在TIL疗法前后治疗数百例黑色素瘤患者的过程中，研究人员发现不同患者的TIL可识别一些相同的肿瘤细胞高表达的抗原，如MART-1、gp100等。基于这些发现，针对这些特定抗原的T细胞将具有潜在的治疗效果。这些尝试，将T细胞疗法推向靶向时代和重组改造时代。

TCR-T (T-cell receptor-engineered T cells) 通过基因导入方法，将抗原特异性TCR导入患者T细胞，制备人工TIL。Steven Rosenberg研究组从一个黑色素瘤患者体内选取了2个TIL细胞克隆: DMF4、DMF5。这两种细胞系都对MART-1/HLAA*02(A2)（一种HLA亚型）有亲和力。患者的外周血T细胞被收集起来，并通过反转录病毒导入DMF4的TCR基因。

这种方法避免了TIL复杂的分离过程，初步临床试验结果在2006年发表，12个黑色素瘤患者中有2位患者有治疗响应。尽管响应率远低于TIL疗法，但初次证实了基因改造的T细胞具有治疗效果。

TCR-T的治疗效果与TCR亲和力有关，低亲和力TCR无法获得高治疗响应率(可达80%)，高亲和力TCR毒性增强，易脱靶 (TCR与机体正常组织抗原发生作用，严重时可致人死亡。)

除了MART-1，临床上常用的TCR-T靶点还包括gp100，CEA、NY-ESO-1、MAGE等。除了自身抗原，也有研究员将目光投向外源抗原，如HPV(人乳头瘤病毒，与宫颈癌发生密切相关)病毒抗原。

TCR-T疗法展示了一定的治疗潜力，但仍有诸多限制，如组织相容性抗原（HLA）配型、抗原需要呈递到细胞表面等。

CAR-T疗法的出现大大拓展了T细胞疗法的应用范围。CAR-T也是通过基因导入方法（腺病毒，慢病毒，非病毒载体方式等），将抗原特异性CAR导入患者T细胞，发挥杀伤肿瘤功能。

CAR由4部分组成: 1,胞外靶抗原结合域 2,铰链区 3,跨膜结合域 4,胞内信号传导结构域。

胞外靶抗原结合域由抗原特异性单克隆抗体scFv (VH和VL通过柔性接头连接构成的单链可变片段) 构成，VH和VL之间的相互作用方式以及互补决定区的相对位置会影响CAR对其目标表位的亲和力和特异性。CAR亲和力是影响CAR功能(识别抗原，传导信号，激活T细胞)的重要指标，同TCR一样，过低过高的亲和力都不能收获理想的效果。除了CAR亲和力，表位位置，靶抗原密度也是CAR设计时需要考虑的问题。

铰链区属于胞外部分，是跨膜结合域在胞外的延伸 (为了与靶抗原结合域连接)。其功能是克服空间障碍，以允许scFv和靶抗原表位结合。长铰链可提供更大的柔韧性并允许更有效地接近膜近端表位或复杂的糖基化抗原，而短铰链更能成功地结合膜远端表位。实际上，通常根据经验确定适当的铰链区长度，并且必须针对每个特定的抗原结合域量身定制。

胞内信号传导结构域直接影响CAR活化T细胞效果。根据结构不同可将CAR分为四代：

三代CAR的主要结构与二代CAR大同小异，但三代CAR使用了慢病毒作为转染载体，与逆转录病毒载体相比，慢病毒载体致癌风险更低，临床应用更安全。同时可携带更大的基因片段进入T淋巴细胞，因此，其CAR胞内段常常可以含有2个或者更多的共刺激信号ITAM区。理论上，第三代CAR-T细胞相较于第二代CAR-T细胞应该更具活化及杀伤能力，然而有研究表明，第三代CAR-T细胞杀伤活性并没有获得明显的提升。

早在2008年，Fred Hutchison肿瘤研究所等机构就开展CAR-T细胞对B细胞淋巴瘤治疗的研究，虽然治疗结果不太理想，但该临床实验证实了表达CD20靶点的CAR-T细胞治疗是相对安全的。

2010年NCI报道了一则通过CD19靶点CAR-T有效控制患者B细胞淋巴瘤的事例，由于CD19在人体B细胞表达，因此CAR-T在体内杀伤过程中，人体正常B细胞也会被清除，同时血清免疫球蛋白显著降低。但值得庆幸的是，人体在一段时间内可耐受B细胞的耗竭，这一报道为CAR-T细胞在B细胞淋巴瘤领域的大规模使用奠定了基础。

2011年，美国宾夕法尼亚大学的Carl June教授及其团队将特异性识别CD19的CAR-T细胞用于B细胞来源的慢性淋巴细胞白血病治疗，显示了“治愈”的疗效，随后在复发难治性急性淋巴细胞白血病展开临床实验，也取得了良好的疗效。

鉴于这一突破性的进展以及其他免疫调控手段的发展，Science杂志将肿瘤免疫治疗评为2013年科技突破进展第一名。由此，CAR-T细胞免疫疗法轰动了世界，各国开始大量开展基于CAR-T细胞的科学研究和肿瘤治疗的临床试验。

然而，CAR-T技术的应用不是没有风险的，其还面临诸多挑战。

幸运的是，CRS一般可以通过减少输注T细胞的数量和/或通过服用抗IL-6受体单克隆抗体和类固醇来缓解。及时管理毒性对于降低与免疫治疗相关的死亡率至关重要，因此，研究人员制定了不同的安全策略来克服和预防CAR-T细胞毒性，如设计新一代的CAR(四代CAR)。毒性管理已成为CAR-T细胞免疫治疗成功的关键步骤。

CAR-T细胞耗竭是患者疾病复发的主要原因。

CAR-T细胞抑制性受体表达增加 (因抗原持续刺激造成，包括PD-1、Lag3、Tim3和TIGIT等)，自身分泌L-2、TNF-α和IFN-γ的能力下降，转录因子、代谢和表观遗传修饰调控等，均可作为CAR-T细胞耗竭的成因。

为避免耗竭，PD-1阻断抗体已被使用以提高CAR-T治疗效果。与此同时，患者靶基因发生突变，也应作为CAR-T细胞治疗效果不佳或复发的考虑因素。

 TCR-T和CAR-T联合杀灭肿瘤细胞

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