给蛋白质装上“开关”，快来看北大科学家们的精妙操作！
编者按
杀死癌细胞分几步？
第一步：把炭疽致死因子“装进笼子”
第二步：把“笼子”放进体内
第三步：打开癌细胞内的“笼子”
可想而知，上述的操作实现的难度要远远胜于“把大象装进冰箱”。毕竟，能装下整只大象的冰箱好造，能“关住”炭疽致死因子的“笼子”不好找，更何况还要给“笼子”装上可以远程遥控的开关。
最近，北京大学化学与分子工程学院、合成与功能生物分子中心陈鹏课题组与王初课题组就一起合作找到了这样的一个“笼子”，能够给蛋白质装上开关，适用于包括炭疽致死因子在内的很多蛋白质。
这项研究成果被称为，基于邻近脱笼策略的蛋白质原位激活技术，研究论文以Time-resolved protein activation by proximal decaging in living systems为题在Nature杂志上发表。（点击文末“阅读原文”可查看文章）
一起来看看，北大的科学家们是如何实现的精妙操作~
在蛋白质上找一个“点”
前文所说的用来“装”蛋白质的笼子，并不是一个封闭的结构，而是一个可以影响蛋白质活性的“开关”。因为，对于蛋白质来说，只要能控制其活性中心的功能，就能实现把它“装进笼子”的效果。
化学生物学领域一直关注用一个“开关”来控制蛋白质活性的问题。可被“操纵”的蛋白质既能助力于细胞生物学、病理学等基础研究，又能在临床实践中有效地治疗癌症等相关疾病。
因此，在蛋白质上找到能够安装调控“开关”的“点”十分重要。
陈鹏课题组先前选择了蛋白质活性位点的氨基酸，提出“化学脱笼”策略，可通过对蛋白质关键残基的化学保护和脱保护反应，实现对其活性的“关－开”调控。
该技术通过对可遗传编码的非天然氨基酸侧链上进行生物正交断键反应和化学脱笼，可被用于激酶等蛋白质家族的特异激活和机制研究，但“直接脱笼“策略只能在某些特定蛋白家族中应用。
由于细胞内蛋白质的种类繁多、活性调控机制各异，目前直接脱笼方法仍受可供脱笼的氨基酸种类限制，无法适用于所有蛋白质。
除了催化中心位点的氨基酸能够直接影响蛋白质活性以外，催化中心附近的其它残基也可以通过稳定蛋白结构、提供底物结合口袋等途径对蛋白质功能产生影响，那么在这些邻近位点上进行保护和脱保护反应，是否同样可以实现对蛋白质活性的选择性调控呢？
基于这一假设，陈鹏课题组与王初课题组展开合作，将计算机辅助设计与可遗传编码的非天然氨基酸技术有机结合，探究并发展了一种普适性的“邻近脱笼”策略。
“邻近脱笼”，顾名思义，该策略选择的“点”是活性中心邻近残基位点。
经过对蛋白质活性口袋内大量氨基酸残基的分析以及模拟突变后对蛋白质结构的影响，作者锁定了带有光保护基团的邻硝基苄基-酪氨酸（ONBY）.
该“可脱笼的非天然氨基酸”可以通过遗传编码的方式被引入到目标蛋白质的“活性中心邻近残基位点”，在紫外光照射后发生光脱笼反应，重新产生天然的酪氨酸。
在蛋白质活性口袋附近插入ONBY后，是通过影响蛋白稳定性和底物结合等因素调控蛋白质活性，而不依赖于蛋白质本身活性点位的性质。因此，该策略将原有的“活性位点脱笼”转变为“活性口袋脱笼”，极大地扩展了其适用范围，可以在活体内实现对不同类型蛋白质的特异性激活。
“邻近脱笼策略” -- 在活性口袋附近定点引入带有光保护基团的酪氨酸，邻位干扰蛋白目标蛋白活性；光脱笼后，蛋白被重新激活
在确定使用ONBY作为一种普适性的蛋白质脱笼氨基酸后，在实际操作过程中，还需要解决的一个问题是：
如何在目标蛋白中快速而又准确地找到插入ONBY的“邻近位点”，从而避免对目标蛋白所有位点进行突变筛选的繁琐实验流程。
为了解决上述问题，王初课题组在这一合作工作中，发展计算机辅助的蛋白质结构设计方法，对目标蛋白中可以插入ONBY的合适邻近位点进行了系统地虚拟筛选，通过计算其所处位置的几何参数以及对蛋白质结构影响的能量参数选出合适的临近位点供实验验证。
这一步骤避免了繁琐的主观人为操作，极大地提高了该方法的成功率和普适性。
基于计算机辅助蛋白质结构设计和虚拟筛选发现“邻近脱笼位点”
至此，作者结合计算机辅助的虚拟筛选和可遗传编码的非天然氨基酸临近脱笼策略建立了普适性原位激活目标蛋白质的研究流程，该方法分为三步：
根据目标蛋白的三维结构，通过生物大分子结构模拟和设计软件Rosetta计算在每一个位点插入脱笼氨基酸（ONBY）对蛋白质稳定性和底物结合能力的影响。然后，选择几何参数和能量参数都符合筛选条件的 “邻近位点”进行实验验证。
通过向计算机推荐的邻近位点引入一种带有光保护基团的非天然酪氨酸（ONBY），实现对其活性的远程干扰和抑制；
对失活蛋白加以紫外光照，通过“光脱笼”反应将保护基团移除，使其活性瞬时重新恢复。
作者将这个方法命名为Computationally-aided and Genetically-encoded Proxmial Decaging, 简称CAGE-prox。
广泛适用于多种蛋白
在建立CAGE-prox的标准操作流程后，两个课题组合作分别在荧光素酶、GTP水解酶、RNA去甲基化酶FTO、蛋白激酶、caspase细胞凋亡蛋白酶和炭疽致死因子（lethal factor）金属蛋白酶等一系列不同类型的蛋白上展示了该瞬时光控激活方法在活体环境下的普适性。
广泛适用于多种蛋白质家族的选择性激活
值得关注的是，上述的7个蛋白中，FTO、KRAS和LF是活性中心分别结合铁、镁和锌离子的金属结合蛋白，其功能直接依赖于这些特定的金属离子。
传统的“直接脱笼”策略很难实现对金属蛋白的选择性激活。
利用CAGE-prox,作者在这些蛋白质上通过计算预测发现了邻近脱笼位点，通过遗传编码插入ONBY实现了对它们的原位激活。
考虑到蛋白组内大约接近一半的蛋白质为金属蛋白，其在广泛的生理活动中发挥关键作用，通过邻位脱笼对这类蛋白质活性的选择性调控具有重要的科学意义。
基础研究&疾病治疗
基础研究方面，作者们利用CAGE-prox不仅建立了活细胞内的激酶正交激活和信号转导系统，还实现了细胞凋亡蛋白酶的瞬时激活和酶切底物的组学鉴定。
他们通过计算预测发现细胞凋亡蛋白酶caspase-3中的邻近位点，插入ONBY后可以特异性激活该蛋白酶，并在1小时内即可诱导细胞产生凋亡表型。
他们进而在这一时间尺度下利用定量蛋白质组学技术对caspase-3瞬时激活后的酶切底物进行了全面分析，发现了239个全新的底物蛋白，极大地拓展了对细胞凋亡初期过程的认识。
发现细胞凋亡中Caspase-3蛋白酶全新底物
转化研究方面，作者通过CAGE-prox实现了炭疽致死毒素蛋白（LF）在活体动物内的可控激活。在将LF递送进入细胞后，通过紫外光控激活其毒性实现对癌细胞的杀伤。
由于结合了紫外光的区域选择性，这一多重靶向系统可以确保LF选择性地杀死肿瘤细胞，对正常细胞无害。该抗肿瘤蛋白质前药的研究策略，具有巨大的临床应用潜力。
激活金属蛋白酶LF作为蛋白质“前药”
总之，CAGE-prox技术突破了原有依赖活性位点“化学脱笼”的瓶颈，为蛋白质找到了灵活调控“开关”，使不同类型的蛋白质得以在活体环境内被高选择性和高灵敏度地瞬时激活。
该研究为基础生物学提供了通用和便捷的化学生物学技术，在基于蛋白质前体药物的转化研究中也具有重大应用潜力。
专家评述
中科院院士、北京大学医学部张礼和教授认为，近年来，在利用生物正交反应对蛋白质的表达、定位进行原位标记和观察基础之上，科学家们还希望能够直接对其功能进行动态研究甚至操控，从而进一步揭示蛋白质机器在复杂生命过程中扮演的角色。
相比于传统的利用小分子抑制剂研究蛋白质功能的方式，通过功能获得型（gain-of-function）的策略研究蛋白质的工作机制将更加有效。
陈鹏课题组此前率先利用基于生物正交断键反应的化学脱笼策略，结合遗传密码子拓展技术，实现了在蛋白质催化位点的生物正交脱笼，进而原位激活其功能。在最新的工作中，他课题组与北大同事王初课题组合作，进一步提出并发展了“邻近脱笼”的新策略，利用计算机辅助设计与筛选，将蛋白质脱笼技术的适用范围从催化位点拓展至整个活性口袋，获得了具有广泛适用性的蛋白质激活新方法。该工作是化学生物学领域的一项重要进展，为在活细胞及活体动物内开展蛋白质动态功能研究提供了关键技术，也为生物正交反应开拓了新的前沿方向。
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中科院院士、中科院上海药物研究所的蒋华良研究员认为，“穷举”的实验办法费时费力，而通过经验观察结构进行挑选则不具有普适性。
这种基于蛋白质结构计算的辅助筛选方法，可以准确地将大量无效的邻近位点快速排除，提高实验尝试的精准度。
这是一个计算机辅助分子设计与化学生物学研究有机结合的经典“计算化学生物学”研究范例，有利于未来进一步推动化学生物学与计算化学、计算生物学和人工智能的交叉融合，促进生物医学和药物研究。
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中科院院士、南京大学化学化工学院郭子建教授认为，金属蛋白是生命体内一类非常重要的蛋白质，在广泛的生理活动中发挥关键作用。因此，通过对单一的金属结合位点的保护和“脱笼”策略实现金属蛋白的选择性激活面临着巨大的挑战。
本工作所发展的邻近脱笼策略，成功地突破了这一限制，在展示的7个例子中，GTPase、FTO和Lethal Factor均是金属蛋白，充分显示出了这一方法在激活金属蛋白的适用性，具有重要的科学意义。尤其是对金属蛋白酶Lethal Factor在活体动物内的激活，系统探究了细菌毒素蛋白作为抗肿瘤蛋白质前药的可能性，具有临床开发潜力。该技术在推动活体环境下金属蛋白功能方面的研究非常值得期待。
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来源：北大科研部，化学与分子工程学院、合成与功能生物分子中心陈鹏课题组、王初课题组，微信公众号“BioArt”
编辑：王艺遥
排版：文婧
责编：以栖